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PCR實(shí)驗(yàn)原理及流程
2023-08-25


所有操作請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行,PCR相關(guān)組分解凍后請(qǐng)充分混勻,用完之后請(qǐng)及時(shí)放回-20℃保存。



標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序




    無產(chǎn)物或產(chǎn)物量少

① 引物:優(yōu)化引物設(shè)計(jì)。

② 退火溫度:設(shè)置退火溫度梯度,找到合適的退火溫度。 

③ 引物濃度:適當(dāng)提高引物濃度。 

④ 延伸時(shí)間:適當(dāng)增加延伸時(shí)間至10 - 15 sec/kb。

⑤ 循環(huán)數(shù):增加循環(huán)數(shù)至36 - 40個(gè)循環(huán)。

⑥ 模板純度:使用高純度模板。 

⑦ 模板使用量:使用量參照反應(yīng)體系推薦量調(diào)整并適當(dāng)增加。


有雜帶或彌散條帶

① 引物:優(yōu)化引物設(shè)計(jì)。 

② 退火溫度:嘗試提高退火溫度并設(shè)置退火溫度梯度。 

③ 引物濃度:適當(dāng)降低引物濃度。 

④ 循環(huán)數(shù):減少循環(huán)數(shù)至25 - 30個(gè)循環(huán)。 

⑤ 反應(yīng)程序:使用兩步法或Touch down PCR程序。 

⑥ 模板純度:使用高純度模板。 

⑦ 模板使用量:使用量參照反應(yīng)體系推薦量調(diào)整并適當(dāng)減少。



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